9月18日，中國科學院上海營養與健康研究所翟琦巍研究組在國際學術期刊Nature Communications在線發表了題為“Discovery of the major 15-30 nt mammalian small RNAs, their biogenesis and function”的研究論文。該研究通過生化分析、新型高通量測序等多種分析鑒定技術，發現了哺乳動物中長度為15-30個堿基(Nucleotide, nt)范圍內的主要的小RNA是3’環磷酸小RNA，初步揭示這些3’環磷酸小RNA的產生機制，并發現其可以存在于Ago2復合物中，以類似于microRNA的方式結合到mRNA的3’非翻譯區(3’-UTR)從而引導目的mRNA的降解，進而發揮生物學功能。該項研究拓展了對哺乳動物小RNA的認識，揭示了哺乳動物中15-30nt長度范圍內的大部分未知小RNA，特別是環磷酸小RNA，初步揭示其產生機制，并發現其具有類似microRNA的重要生物學功能。

　　小RNA是一類生物體內具有重要生物學功能、通常長度小于200nt的RNA。目前在15-30 nt長度范圍內已經發現了多種類型的小RNA，例如microRNA、piRNA、tRNA-derived small RNA (tsRNA)以及small rDNA-derived RNA (srRNA)等。然而，這些小RNA是否是15-30 nt長度范圍內的主要小RNA還并不清楚。

　　研究人員使用小鼠肝臟分離純化了大量的15-30nt長度的小RNA，讓這些小RNA通過常規的電泳染色就能清晰觀察到。隨后，通過T4 RNA ligase 2催化的3’羥基(3’-OH)小RNA與5’預腺苷化接頭的連接反應，發現這些15-30nt長度的小RNA絕大多數并不是3’-OH；僅當使用T4多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase, T4 Pnk)催化處理后，才能幾乎全部被連接上接頭。進一步的質譜分析及大量不同細胞或組織的多種生化分析發現，哺乳動物15-30nt長度的小RNA的3’末端主要為環磷酸(2’,3’-cyclic phosphate, 2’,3’-cP)，含量約為90%，這些小RNA可以稱為3’環磷酸小RNA (sRNAs with 3’-cP, sRNA-cP)。為了進一步解析這些sRNA-cP，研究人員建立了一種可以在一個樣品中同時檢測sRNA-OH和sRNA-cP的新型高通量測定小RNA序列信息的方法，稱為TANT-seq (T4 Rnl2/AP/NaIO4/T4 Pnk (3’ phosphatase minus)/RtcB-based sRNA-seq)?；赥ANT-seq高通量測序，揭示了大量的sRNA-cP和sRNA-OH的序列信息，并發現sRNA-cP和sRNA-OH通常具有不同的序列。

　　為了便于分析不同3’末端的小RNA，研究人員建立了一種可以同時檢測3’-OH、3’-P和3’-cP的基于定量PCR的技術方法TE-qPCR (triplex-3’-end qPCR)?；赥E-qPCR技術方法對許多sRNA-cP和sRNA-OH進行了驗證，并發現很多sRNA-cP和饑餓、肥胖、糖尿病等生理病理狀態有關，提示sRNA-cP有重要的生物學功能。

　　哺乳動物15-30nt長度的小RNA主要為sRNA-cP，但這些小RNA究竟是在分離純化RNA過程中隨機降解產生的，還是在細胞內特異性加工產生的還有待解答。通過對sRNA-cP的末端序列特征分析發現，其3’末端主要為嘧啶堿基，而5’末端主要為嘌呤堿基。根據已知的細胞內各種RNA內切酶的序列識別特征，通過逐步的體外篩選以及后續的基因敲除和過表達等技術發現，ANG和RNase4介導了部分sRNA-cP的產生。

　　有研究報道microRNA、tsRNA、srRNA、snoRNA、snRNA、sinRNA、smRNA、piRNA、srpRNA以及smcRNA等小RNA都可以和Ago2結合，特別是microRNA已經被廣泛報道可以通過和Ago2結合靶向目標mRNA的3’非翻譯區從而降解目標mRNA或抑制其翻譯。哺乳動物15-30nt長度的主要小RNA sRNA-cP是否也可以類似于microRNA和Ago2結合，從而發揮生物功能呢？研究人員通過免疫沉淀獲得了Ago2復合物，隨后抽提獲得了Ago2復合物中的RNA，并通過TANT-seq測序分析了其中的小RNA。研究發現Ago2復合物中，最主要的15-30nt小RNA也是sRNA-cP，含量約為80-90%，而microRNA僅占sRNA-OH的約10%，相當于Ago2復合物中sRNA-cP的含量大約為microRNA的近100倍。Ago2中這么大量的sRNA-cP，如果大部分都能發揮生物學功能，其作用和意義甚至有可能會高于microRNA。

　　為了研究這些Ago2復合物中的sRNA-cP的生物學功能，研究人員參考microRNA進行了生物信息學預測，通過熒光素報告基因篩選了一系列可能靶向的3’-UTR。從40個候選sRNA-cP預測的107個靶向的3’-UTR中，篩選出16個sRNA-cP和對應的18個3’-UTR正反向都能有兩倍以上的調控效應。進一步的研究發現其中大部分都能正反向有效調控相應的mRNA水平，并且其中有些還進一步驗證了相應的正反向的對于蛋白表達水平的調節作用。其中發現的snR-2-cP可以通過依賴于Ago2的方式，靶向著名的抗凋亡基因Bcl2的mRNA的3’-UTR靶位點，下調Bcl2的mRNA和蛋白水平，從而調控細胞凋亡。

　　為了進一步驗證sRNA-cP是否可以結合Ago2并引導識別和剪切靶序列，研究人員分離純化轉染了特定小RNA的Ago2復合物，在體外添加相應的小RNA識別的靶序列。在該體外研究體系中可以清晰觀察到sRNA-cP可以序列特異性地引導對于靶序列的識別和剪切，并且對于靶序列的剪切位置與microRNA一致，都發生在與小RNA互補的靶序列的第10和第11個堿基之間。此外，通過直接分離純化Ago2復合物，在體外添加相應的小RNA和小RNA識別的靶序列，也發現具有相一致的效果。進一步研究發現，sRNA-cP發揮作用時不依賴于其3’-cP。

　　該研究工作開辟了小RNA研究的新方向，為后續大量sRNA-cP的生理病理相關性及其生物學功能揭示奠定了基礎，也將對整個小RNA研究領域產生重要影響，有望成為分子生物學領域的里程碑性工作。

　　中國科學院上海營養與健康研究所賴和勁博士和馮寧博士為該論文共同第一作者。翟琦巍研究員為該論文的通訊作者。該研究工作得到了科技部國家重點研發計劃、國家自然科學基金委、中國科學院戰略性先導科技專項、中國科學院前沿科學重點研究項目和上海領軍人才項目等的資助，也獲得了中國科學院上海營養與健康研究所公共技術平臺和動物平臺的支持。

哺乳動物15-30nt主要小RNA的分析鑒定及其產生機制和功能的示意圖

　　論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-41554-6